Ze vormen zelf synapsen

Naarmate wij zoogdieren ouder worden, beginnen velen van ons ons gezichtsvermogen te verliezen omdat de zenuwcellen in ons netvlies verslechteren. Retinale ganglioncellen kunnen worden aangevallen door glaucoom, of onze staafjes en kegeltjes (fotoreceptoren) kunnen worden weggesleten door maculaire degeneratie of retinitis pigmentosa. Ergens tijdens de evolutie verloren we ons vermogen om dat soort cellen te regenereren, net zoals we het vermogen verloren om ledematen te regenereren. Als ze eenmaal weg zijn, zijn ze weg.

Maar wij mensen hebben een aantal andere dingen heel goed ontwikkeld: het vermogen om de rede te gebruiken en het verlangen om onszelf te behouden. Deze eigenschappen hebben ons op het punt gebracht om enkele van onze evolutionaire tekortkomingen te compenseren.

Het is verbazingwekkend genoeg Dat kunnen we nu Menselijke stamcellen groeien uit tot retinale “organoïden” – kleine balletjes Het bevat Alle verschillende soorten cellen die nodig zijn voor het functioneren van het netvlies, zodat ze in de juiste lagen zijn georganiseerd.

Maar we hebben nu geleerd dat als we organellen uit elkaar halen tot individuele cellen, deze cellen automatisch signaalgeleidingsverbindingen kunnen vormen (klemmen) met andere netvliescellen. Dit betekent dat een patiënt zijn eigen stamcellen kan laten uitgroeien tot netvliescellen en op zijn eigen netvlies kan worden aangebracht, en dat deze functioneel nieuwe cellen de oude kunnen vervangen en het gezichtsvermogen kan worden hersteld. Geen gentherapie nodig, heel erg bedankt.

Over deze laatste hindernis lees je alles kom hierheen In de laboratoria van de Universiteit van Wisconsin van Dr. David JamW Xinyu Zhao Fei 4 januari nummer van Procedures van de National Academy of Sciences.

Vorig jaar was het Gam Lab getoond dat staafjes en kegeltjes (fotoreceptoren) gemaakt van stamcellen net als gezonde cellen op licht kunnen reageren. Dit is een geweldige ontwikkeling voor het maken van individuele cellen voor therapie, maar om ze deel uit te laten maken van een functioneel netvlies, moeten die staafjes en kegeltjes hun signalen kunnen doorgeven aan de rest van het netvlies. Het vindt plaats via synapsen, de ultradunne verbindingen tussen neuronen waardoor signaalmoleculen (Meestal glutamaat) geslaagd:

Retinale organellen (RO’s) gaven Bridle en Zhao hoop dat defecte delen van het netvlies gereconstrueerd zouden kunnen worden om echt te zijn uit stamcellen, omdat niet alleen alle geslachtscellen de lagen vormen die ze zouden moeten vormen, maar ze ook connecties maken aan elkaar in de RO met klemmen. Je kunt zien hoe vergelijkbaar de structuur van RO is met het echte netvlies met betrekking tot celtypes en synapsen (geverfd in groen):

Dus de vraag is, als we deze RO-cellen uit elkaar halen en de juiste in het netvlies van de patiënt plaatsen, zullen ze dan in staat zijn om deze synapsverbindingen opnieuw te maken? Dat is wat Gamm en Zhao Labs hier wilden testen.

Ze breken sommige RO’s af met papaïne, een enzym uit papaja dat wordt gebruikt als vleesvermalser en helpt bij de spijsvertering, maar het is ook een gunst Om synapsen te vernietigen. (Dus geen papaïne rechtstreeks in je oogballen geïnjecteerd, oké?)

Na de lijmbehandeling zagen ze dat de eiwitten die belangrijk zijn voor de functie van de synapsen gelukkig nog aanwezig waren, maar ze stuiterden min of meer terug in de cellen. Het lijkt er dus op dat cellen een goede kans hebben om synapsen met elkaar te herstellen als ze hun oriëntatie weer kunnen herwinnen.

Ze kweekten deze RO-cellen samen als individuen gedurende 20 dagen op een plaat, in een situatie die vergelijkbaar is met wat ze zouden tegenkomen wanneer ze op echte netvliezen zouden worden aangebracht. Maar hoe weet je of neuronen deze kleine synapsen hebben gevormd en of deze synapsen werken?

Gelukkig is er een geweldige manier om dit te doen, genaamd “synaptic tracing”. Het blijkt dat het rabiësvirus tussen zenuwcellen kan reizen Alleen maar Door synapsen te laten werken, zodat we het kunnen gebruiken om niet alleen te zien of er synapsen aanwezig zijn, maar ook hoe goed ze werken. (Dit lijkt een goed moment om het rabiësvirus toe te voegen aan de zeer lange lijst van dingen die nog steeds groeien en die niet in de oogbollen mogen worden geïnjecteerd.)

De manier waarop het is gedaan is best cool, en blijf bij me, want aan het einde krijg je wat kleurenfoto’s die heel duidelijk zullen maken wat er is gebeurd.

Eerst moeten we ervoor zorgen dat het rabiësvirus slechts een klein percentage van onze cellen infecteert zonder de hele cultuur te plunderen, en we moeten deze cellen ook op de een of andere manier markeren als “starters”. We moeten dus eerst wat voorbereiden.

We beginnen met een ander virus – het lentivirus – waarin we een gen voor groen fluorescerend eiwit (GFP) hebben ingebracht dat we op de kern hebben gericht. We zullen dan alle cellen kunnen detecteren die zijn geïnfecteerd met ons lentivirus, omdat ze een grote groene stip in het midden hebben. We kunnen wat vallen en opstaan ​​doen met de hoeveelheid lentivirussen die we gebruiken totdat ongeveer 5% van onze cellen geïnfecteerd is.

We zullen nog twee genen in ons lentivirus stoppen, TVA en Rgp genaamd, en we zullen binnen een seconde leren waarom deze twee genen belangrijk zijn.

Dan infecteren we onze cellen met het hondsdolheidsvirus, maar we veranderen het gen voor het vachteiwit. Normaal gesproken is dit Rgp, maar we gaan het vervangen door een andere genaamd Env. Virussen die Env als hun envelop-eiwitten gebruiken, kunnen alleen cellen infecteren die TVA bevatten, en dat is precies waarom we TVA in cellen met groene stippen stoppen. Nu kunnen we het rabiësvirus in de kweek stoppen en het infecteert alleen de groene blobcellen.

We zullen een gen voor mCherry (een rood fluorescerend eiwit) in ons rabiësvirus stoppen, zodat alle cellen die ermee zijn geïnfecteerd overal in de cel een rode kleur hebben en met rabiës geïnfecteerde cellen gemakkelijk te herkennen zijn. Dus de “startcellen” met de groene stippen krijgen hondsdolheid omdat ze allemaal TVA in zich hebben, en dit zal onze “startcellen” feestelijk rood en groen kleuren.

Onthoud dat we ook het Rgp-gen in het lentivirus stoppen, dus onze groene puntcellen maken ook het Rgp-eiwit. Zodra het hondsdolheidsvirus onze groene blob-cellen infecteert, zullen ze hun oorspronkelijke envelop-eiwit herstellen, terugkeren naar hun oude zelf, en… oh.

Nu zijn ongeveer 5% van onze cellen rood-groene “startcellen”, en ze kunnen andere cellen in het kweekmedium infecteren met hondsdolheid (en ze de rode kleur geven) Alleen als ze door middel van klemmen met andere cellen zijn verbonden! Als dat gebeurt, zouden we rode cellen zonder groene stip moeten zien – dat wil zeggen hondsdolle cellen die geen initiatorcellen waren. BAM! Er zijn uw percepties, laten we er nu naar toe gaan …

Een goede controle om mee te beginnen is het hele systeem waar we het net over hadden, maar er zit geen Rgp in het langzame virus. Dit betekent dat de initiërende cellen geen andere cellen mogen infecteren, omdat rabiës zijn natuurlijke omhullingseiwit niet bevat. Alles wat we zouden moeten zien zijn de startcellen, die rood en groen gekleurd zijn.

Dus de kleine afbeelding links hieronder toont rode en groene initiërende cellen die geen andere cellen kunnen infecteren, zelfs als er actieve synapsen zijn. De blauwere afbeeldingen aan de linkerkant bevatten een extra plek genaamd DAPI, die DNA in blauw detecteert, zodat elke cel blauw lijkt. Zo kun je het percentage geïnfecteerde cellen visualiseren als startcellen. Dan halen we aan de rechterkant de blauwe DAPI weg totdat je alleen rood en groen ziet. Merk op dat elke rode persoon ook een groene stip heeft.

Laten we nu de echte test doen, de Rgp zit in het lentivirus, dus nu kan het rabiësvirus andere cellen infecteren, maar Alleen via actieve klemmen. Dezelfde deal voor kleuren, nu hopen we enkele rode neuronen te zien:

We zien veel rabiësinfectie in niet-initiërende cellen, wat betekent dat we actieve synapsen hebben! En dat betekent dat we dat zijn aan klinische proeven!

De technologie aanpassen om menselijke oogaandoeningen te behandelen op basis van ontdekkingen van UW-Madison, zegt Jam, die de organische stoffen patenteerde en mede-oprichter was van het in Madison gevestigde Opsis Therapeutics. “Dit alles leidt uiteindelijk tot klinische proeven bij mensen, wat de voor de hand liggende volgende stap is.”

Nadat ze het bestaan ​​van de synapsen hadden bevestigd, analyseerden de onderzoekers de betrokken cellen en ontdekten dat de meest voorkomende soorten netvliescellen die synapsen vormen fotoreceptoren waren – staafjes en kegeltjes – die verloren gaan bij ziekten zoals retinitis pigmentosa en leeftijdsgebonden maculadegeneratie. degeneratie. Zoals bij sommige oogletsels. Het op een na meest voorkomende type cel, de retinale ganglioncellen, degenereert bij oogzenuwaandoeningen zoals glaucoom.

“Dit was een belangrijke openbaring voor ons”, zegt Jam. “Het toont echt de potentiële brede impact die deze retinale organellen kunnen hebben.”